解析細胞凍存液和培養(yǎng)基的配制
1、準(zhǔn)備工作

（1）細胞培養(yǎng)基： 1L； ：L-15:500ml； 配置量： 配方 DMEM:350ml； Ham’s F12:150ml；NaHCO3：1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mgEGF:50μg滅活 FBS:50ml；雙抗：10ml

（2）冷凍保護液：配制量：40ml；配方：FBS:8ml；DMSO:3ml；培養(yǎng)基：29ml

2、細胞培養(yǎng)基配制方法 FBS*天準(zhǔn)備工作： 兩支， 提前一晚四度冰箱解凍； 烘干硅膠（用于第二天干燥盒干燥 insulin）

（1）細胞培養(yǎng)基配制準(zhǔn)備工作：1L 廣口瓶三個，提前高溫高壓滅菌（用于盛放培養(yǎng)基） ；1L 燒杯一個，三個，；50ml 離心管 22 支 ；

（2）取一包 Ham’s F12 干粉加入到 800LddH2O 中將溶液反復(fù)沖洗包裝內(nèi)面兩次，倒入培養(yǎng)液中，使干粉充分溶解； 將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到 1L 兩桶中， 取少量 ddH2O 潤洗燒杯， 定容至 1000ml。同樣方法配制 L15 培養(yǎng)基和 DMEM 培養(yǎng)基。

（3）取 L-15:500ml；DMEM:350ml；Ham’s F12:150ml 加入到大燒杯中，配制成混合培養(yǎng)基。

（4） 取 NaHCO3： 稱 1.5gHEPES:3.57ginsulin:10mg全部溶于混合培養(yǎng)基， Insulin 放置于-20℃ 。冰箱中，置于室溫的時候冰晶解凍為水滴，影響胰島素稱量精度，故需要放置到干燥盒中干燥 30min-60min； 稱量裝置為精細天平， 打開精細天平后， 打開倉門， 放置一張干凈稱量紙，按 TARE 鍵清零。用擦凈的藥匙取極少量干粉，觀察示數(shù)，加至 0.0100g。小心取出稱量紙，將干粉加入到培養(yǎng)基中， 用食指輕輕彈稱量紙使剩余粉末進入培養(yǎng)基， zui后用少量培養(yǎng)基溶液沖洗稱量紙，保證所有 insulin 進入培養(yǎng)基。

（5）利用 NaOH 溶液調(diào) PH 值至 7.5：用之前調(diào)好 PH 測量器，分別在 7.0、10.0、4.0 處調(diào)試PH，確定后測定 PH。

（6）加入雙抗溶液 10ml。

（7）在超凈臺上利用 0.2μm 濾膜過濾除菌（這步驟工作量較大，需要兩個同學(xué)完成） 。大概過濾 200ml 后濾膜會堵住，需要重新更換。

（8）FBS 滅活：提前約 15min 將水浴鍋打開，溫度設(shè)置在 54℃（本實驗室水浴鍋溫度通常高于實際溫度 2℃，實際溫度以溫度計為準(zhǔn)） 。用樣品袋包裝盛放 FBS 的 50ml 離心管，擠出空氣，放置在 56 攝氏度下滅活 30min。

（9）FBS 分裝：分裝到兩個 15ml 離心管和 20 個 EP 管中，放置于-20℃冰箱中

（10）分裝：分裝到 50ml 離心管中，4℃保存。細胞培養(yǎng)基使用前加入 2.5mlFBS，250μlEGF溶液（EGF 溶液濃度為 10ng/μl）。

3、細胞凍存液配制：將 FBS:8ml；DMSO:3ml；培養(yǎng)基：29ml 加入到 50ml 離心管中，混勻。

（1）凍存前一天，更換培養(yǎng)基。

（2）吸出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用 0.05胰酶-EDTA 消化細胞（根據(jù)培養(yǎng)面積加入相應(yīng)胰酶試劑），5min，吹散細胞。

（3）加入與胰酶-EDTA 等量的培養(yǎng)基，終止消化；然后 1000rpm，離心 5min。

（4）去除上清，加入適量培養(yǎng)基（在 EP 管架上滑動，使細胞分散，之后用槍頭輕柔吹打，使細胞*均勻懸?。?；進行細胞計數(shù)：細胞計數(shù)，取細胞計數(shù)器，每孔加 10μl 細胞懸液，在計數(shù)區(qū)（中央 25 個格子） ，用細胞計數(shù)器計數(shù)，移動計算下方計數(shù)區(qū)細胞數(shù)量。細胞總量計算公式，AB/2稀釋倍數(shù)106。AB 為上下兩個計數(shù)區(qū)細胞總數(shù)。

（5）1000rpm 離心 5min。

（6）加入適量凍存液（在 EP 管架上滑動，使細胞分散，之后用槍頭輕柔吹打，使細胞*均勻懸?。辜毎鹺ui終濃度達到 1-3106cell/ml。

（7）將細胞懸液加入到凍存管中，每管 1ml：凍存管提前用標(biāo)簽筆寫入如下信息，細胞名稱，傳代次數(shù)，細胞數(shù)量，凍存日期。

（8）取出凍存盆，在通風(fēng)櫥中向槽內(nèi)加入適量異丙醇（因為異丙醇具有微毒性）。將凍存管插入到凍存盆的凹槽中，放于-80℃冰箱中過夜。

（9）第二天早上將凍存管轉(zhuǎn)至液氮中：用棉紗布包裹凍存管，用粗棉繩扎緊，打上標(biāo)簽，寫上凍存日期，細胞種類，傳代次數(shù)，細胞數(shù)量。