無血清培養(yǎng)基中應(yīng)該添加鐵飽和(Holo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白，還是脫鐵(Apo)的轉(zhuǎn)鐵蛋白?

我們知道，一個(gè)轉(zhuǎn)鐵蛋白可以高親合力結(jié)合 2 個(gè) Fe3+。結(jié)合了 2 個(gè) Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白，

因其鐵離子結(jié)合位點(diǎn)均已被占用，所以稱為鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白，英文為Holo-transferrin，holo

是全部、*的意思。而未結(jié)合 Fe3+的轉(zhuǎn)鐵蛋白則稱為脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，英文為 Apo-transferrin，其中 Apo 是分離的意思。

重組的轉(zhuǎn)鐵蛋白zui初均為 Apo-transferrin，要得到 Holo-transferrin 則需在酸性環(huán)境下

與一定量的六水硫酸鐵銨作用，然后再將 pH 值調(diào)至堿性，再作用一段時(shí)間即可。體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，Apo-transferrin 與細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的親合力很弱，但當(dāng)其結(jié)合細(xì)胞外環(huán)境中的 Fe3+形成 Holo-transferrin 后，與細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的親合力顯著提高，進(jìn)而介導(dǎo)了對鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。

那么在配制無血清培養(yǎng)基時(shí)，是應(yīng)該添加 Holo-transferrin（飽和） 還是 Apo-transferrin（脫鐵） 呢?

無血清培養(yǎng)基中多數(shù)都添加 Holo-transferrin（飽和），因?yàn)?Holo-transferrin （飽和）除發(fā)揮轉(zhuǎn)鐵作用外，自身即可作為細(xì)胞的鐵源，無需在培養(yǎng)基中另加外源性鐵。但在某些本身含鐵量高的培養(yǎng)基(如 DMEM/F12)中，則可使用 Apo-transferrin 這種不含鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白。

另外需要注意，通常我們無法從理論上推斷出到底是 Holo-transferrin 好還是 Apotransferrin好，zui準(zhǔn)確的方法是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試。

有報(bào)道在神經(jīng)細(xì)胞無血清培養(yǎng)時(shí)，添加物 B27與Holo-transferrin 合用會比與transferrin 合用獲得更好的神經(jīng)元培養(yǎng)質(zhì)量[1]。而另一種添加物 N2，與 Apo-transferrin合用時(shí)則會提高某些神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力。

小結(jié)：無血清培養(yǎng)基一般添加鐵飽和轉(zhuǎn)鐵蛋白作為細(xì)胞鐵源。

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轉(zhuǎn)鐵蛋白在無血清培養(yǎng)基中的作用之一

維持細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡

轉(zhuǎn)鐵蛋白的這個(gè)功能也很重要。對于細(xì)胞而言，并不是鐵越多越好，而應(yīng)當(dāng)是在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間獲得適量的鐵。如果細(xì)胞內(nèi)的鐵過多，也跟細(xì)胞外環(huán)境一樣，鐵會誘導(dǎo)產(chǎn)生破壞力*的羥基自由基。而如果細(xì)胞內(nèi)鐵過少，則不足以維持細(xì)胞的生長和增殖。

那么轉(zhuǎn)鐵蛋白是如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鐵平衡的呢？這與細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體有關(guān)。

細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)目不是固定不變的，而是隨著細(xì)胞對鐵的需求程度而上調(diào)或下調(diào)，因而可自主影響細(xì)胞對鐵的攝取量。

一般而言，靜止未活化的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體相對較少，而活化增殖的細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體數(shù)目顯著增加。如淋巴細(xì)胞在有絲分裂因子的刺激下會發(fā)生轉(zhuǎn)化，在 DNA 合成前數(shù)小時(shí)，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)目明顯上調(diào)，鐵攝入也相應(yīng)增加。而到了有絲分裂期，淋巴細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體數(shù)目又明顯減少，這時(shí)細(xì)胞對鐵的需求量也降低了。腫瘤細(xì)胞均為快速增殖的細(xì)胞，所以相對于正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面存在著大量的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，以滿足腫瘤細(xì)胞對鐵的大量需求[2]。

此外，在細(xì)胞培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體數(shù)目與培養(yǎng)環(huán)境中鐵的含量也密切相關(guān)。

培養(yǎng)環(huán)境中的含鐵介質(zhì)比較多，則細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的數(shù)目會減少，從而避免細(xì)胞攝入過量的鐵[2]。

既然轉(zhuǎn)鐵蛋白的作用僅是向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子，然后通過鐵離子來發(fā)揮維持細(xì)胞生長和增殖的作用，于是有研究者試圖在無血清培養(yǎng)基中加入鐵離子螯合劑，以將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，從而供細(xì)胞的生長所需，這樣可以避免使用轉(zhuǎn)鐵蛋白，使配制出無蛋白成分的無血清培養(yǎng)基成為可能。鐵離子螯合劑雖然也取得了部分成功，但對于絕大多數(shù)細(xì)胞并不能很好地維持細(xì)胞的生長，原因是鐵離子螯合劑只有轉(zhuǎn)鐵作用，但無調(diào)節(jié)鐵平衡的能力，常會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鐵含量過多，進(jìn)而產(chǎn)生自由基并使細(xì)胞受到損傷[3,4]。

參考文獻(xiàn)

[1] Chen Y, Stevens B, et al. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. J Neurosci Methods. 2008;171(2):239-47.

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[4] Eto, N, Yamada K, et al., Development of a protein-free medium with ferric citrate substituting transferrin for the c*tion of mouse-mouse hybridomas. Agric Biol Chem. 1991;55(3):863-5.

資料來源：BioGems